نشانگر ها و نشانگر مولکولی

1-8-نشانگر مولکولی

1-9-انواع نشانگرهای مولکولی..

1-9-1-نشانگرهای مورفولوژیکی..

1 -9-2-نشانگرها بیوشیمیایی..

1-9-3-نشانگرهای DNA..

1-10-انواع نشانگرهای مولکولی جدید.

1-10-1-RFLP.

1-10-2-RAPD..

1-10-3- AFLP.

1-10-4- SSR..

1-10-5- نشانگر مولکولی ISSR..

1-10-5-1-مزایای نشانگر مولکولی ISSR..

1-10-5-2-کاربردهای نشانگر مولکولی ISSR..

1-10-5-3-منشاء چند شکلی در ISSRها

1-11- گیاه­شناسی..

1-12- ریشه.

1-13-ساقه.

1-14-گل..

1-15-میوه

1-16-برگها

1-17-کاشت…

1-18- برداشت…

فصل دوم : بررسی منابع نشانگر مولکولی

2-1- نشانگر.

2-2-انواع نشانگر.

2-2-1-نشانگر RAPD..

2-2-2-نشانگر AFLP.

2-2-3-نشانگر SSR..

2-2-4-نشانگر ISSR..

منابع نشانگر مولکولی

نشانگرهای مولکولی[1]

مفهوم نشانگر ژنتیکی[2] موضوع جدیدی نمی­باشد .در قرن نوزدهم، گرگور مندل نشانگرهای ژنتیکی مبتنی بر فنوتیپ را در ازمایش­های خود به کار برد. پس از آن نشانگر ژنتیکی مبتنی بر فنوتیپ برای مگس سرکه[3] منجر به پیدایش نظریه پیوستگی ژنی شد. این مفهوم زمانی تحقق می­یابد که مکان­های ژنتیکی نزدیک به هم، همزمان و با هم به ارث برده می­شوند (موندینی[4] و همکاران، 2009).

هر گونه نشانه، علامت و یا صفت بیان کننده یک خصوصیت خاص را به شرط وراثتی بودن آن می­توان نشانگر[5] نامید. انواع مختلفی از نشانگرها در عرصه علوم ژنتیک، رده­بندی و به نژادی به کار رفته است. اصول کاربرد همه آنها تفاوت چندانی ندارد، ولی هر کدام دارای معایب ومزایا خاص خود هستند و البته تمام آن­ها به نوبه خود ارزشمند می­باشد. یک نشانگر حداقل باید دو ویژگی کلی داشته باشد: (الف) در بین افراد جامعه متفاوت باشد و به عبارتی چند شکلی[6] کافی داشته باشد (ب) منشاء ژنتیکی داشته باشد و کمتر تحت تاثیر شرایط محیطی قرار گیرد (میردریکوند و همکاران، 1383).

یک نشانگر ایده­ال باید چند ویژگی داشته باشد :

• 1-چند شکلیداشته باشد و بطور یکنواخت در سراسر ژنوم پراکنده باشد
• 2-وضوح کافی برای تفاوت­های ژنتیکی ایجاد کند
• 3-نشانگرهای قابل اعتماد، مستقل و متعدد تولید کند
• 4-ساده ، سریع و ارزان باشد
• 5-مقدار کمی از بافت یا  DNAنیاز داشته باشد
• 6-با فنوتیپ مشخصی رابطه داشته باشد
• 7-هیچ اطلاعات قبلی درباره ژنوم یا ارگانیسم لازم نباشد  (موندینی و همکاران، 2009).

چند شکلی در نشانگر مولکولی ، می­تواند در سه سطح فنوتیپی (مورفولوژیکی )، تفاوت در پروتئین­ها (بیوشیمیایی) و تفاوت در سطح توالی نوکلئوتیدی­های DNA آشکار شود.

انواع نشانگر مولکولی

با وجود اینکه بهره­مندی از علم ژنتیک و اصلاح نباتات بیشترین نقش را در افزایش محصول و تولید فراورده­های غذایی به عهده داشته است، به دلیل رشد روزافزون جمعیت، تلاش بیشتری برای چیرگی بر شرایط نامساعد محیطی، اعم از عوامل زیستی و غیرزیستی و افزایش کیفیت محصول لازم است. در سالهای اخیر پیشرفت­های تحسین برانگیزی که در زمینه­ی زیست شناسی مولکولی و بیوتکنولوژی صورت گرفته، ابزار قدرتمندی را برای پژوهش­های ژنتیک تفصیلی گیاهان عالی از جمله گیاهان زراعی فراهم کرده­اند. شاید اساسی­ترین و مفیدترین این ابزار نشانگرهای DNA باشند که همان تفاوت­های قابل ثبت ردیف­های بازی DNA موجود بین دو یا چند نمونه­اند. امروزه اطلاعات به دست آمده از نشانگر مولکولی DNA کاربردهای بسیاری دارند، که عمده­ترین آنها در پزشکی قانونی، طبقه­بندی موجودات زنده و اصلاح نباتات است (نقوی و همکاران، 1388).

(پاورقی)

[1] Molecular-marker

[2]genetic marker

[3] Drosophila melanogaster

[4] -Mondini et al

[5]marker

[6] polymorphis

انواع نشانگرهای مولکولی جدید

RFLP[1]

نشانگرهای مولکولی DNA عموما چند شکلی توالی DNA را بدون توالی­یابی بررسی و ارزیابی می­کنند. اولین نسل نشانگرهای DNA بر مبنای هیبریداسیون کاوشگر با توالی خاصی از DNA  شکل گرفته­اند. از جمله نشانگرهای مبتنی بر هیبریداسیون، می­توان به نشانگرهای RFLP که بر مبنای تنوع طولی قطعات حاصل از برش توسط آنزیم­های برشی شکل گرفته­اند اشاره نمود (باقری  و همکاران، 1386). پلی­مرفیسم­های[2] طولی قطعات برشی (RFLP)، با استفاده از آنزیمهای برشی[3]، مولکولهای DNA ژنومی را در توالی های نوکلئوتیدی خاصی (محل های برش) برش داده و بنابراین قطعات DNA با اندازه های مختلف را بوجود می آورند(بوتستین و همکاران[4]، 1980).

از معایب RFLP می­توان به موارد ذیل اشاره نمود:

دشواری، پیچیدگی و وقت­گیر بودن آن

RFLP ژنوم­های بزرگ نیازمند کاربرد مواد پرتوزا یا روش­های پیچیده­تر و گران­تر بیوشیمیایی است.

هزینه اولیه زیاد و هزینه نسبتا زیاد نگاهداری کاوشگرها و کاربرد آنها، RFLP را گران کرده است.

در گونه­های بسیار نزدیک به همدیگر این نوع نشانگرها آلل­های مشابهی را نشان می­دهند (نقوی و همکاران، 1388)

RAPD[5]

در سال 1990 تکنیکی به نام DNA چند شکل تکثیر شده تصادفی یا اختصاراً RAPD توسط دو گروه مستقل ویلیامز و همکاران و لش و همکاران معرفی شد، که اساس آن تکثیر نواحی اتصال پرایمر در DNA ژنوم، با استفاده از واکنش PCR می­باشد (نقوی و همکاران، 1388). اتصال رقابتی آغازگرها و تولید باندهای مصنوعی و برهمکنش داخل و بین رشته DNA در طی PCR، هنوز بعنوان یک مشکل بالقوه RAPD پا برجاست. بنظر می­رسد برخی از این مشکلات مانند تکرار­پذیری، احتمالاً بعلت آغازگرهای طویل­تر و دمای اتصال بالاتر، برای [6]AFLP و ISSR[7]، از RAPD کمتر است (نیبوم[8]، 2004).

نتایج این تکنیک معمولاً در پاسخ به تغییرات کوچک مانند شدت اتصال آغازگر، که شرایط آزمایشی آن را تغییر می­دهد به میزان زیادی متغیر است. بنابر این قابلیت تکرارپذیری و امکان استفاده از آن در آزمایشگاه­های مختلف در این تکنیک بعضاً دچار مشکل شده و کاربرد آن را محدود می­کند (سلطانلو و همکاران، 1388).

 AFLP[9]

این نشانگر اولین بار در سال 1395 توسط ووس و همکاران معرفی شد. AFLP، تکنیکی بر پایه تکثیر بخشی از قطعات هضم شده حاصل از هضم DNA کلی با استفاده از PCR است. محصولات تکثیر شده با رنگ­های فلورسنت یا رادواکتیو نشاندار شده و بر روی ژل توالی­یابی و تفکیک می شوند. این تکنیک ابزار مولکولی قوی و قابل اعتمادی در بررسی چند شکلی DNA است (لاموت و همکاران، 2002).

پیچیدگی نسبی در مقایسه با سایر روش­های مبتنی بر PCR و غالب بودن این نشانگر که موجب عدم امکان تشخیص افراد خالص از ناخالص می­­گردد، استفاده از این تکنیک را محدود می­کند. همچنین هضم ناقص DNA باعث تولید باند­های مصنوعی می­شود و ردیابی این مشکل سخت است مگر اینکه نمونه­برداری از بافت گیاه در مراحل مختلف در طی فصل رشد و از اندام­های مختلف انجام شود (نیبوم، 2004).

از معایب این نشانگر می­توان به موارد ذیل اشاره نمود:

• پیچیدگی نسبی این روش در مقایسه با سایر روش­های مبتنی بر PCR
• عدم اطلاع از جایگاه ژنی نشانگرها

 SSR[10]

ژنوم موجودات عالی، انباشه از نسخه­های متعدد توالی­های ساده DNA می­باشند که با اندازه­های مختلف در تمام طول ژنوم پراکنده شده­اند. در صدر این توالی­ها، DNA ماهوار[11]ه قرار دارد، که حاوی قطعات 100 جفت باز یا بیشر می­باشد که طول آن­ها به چندین مگا جفت باز نیز می­رسد. بعد از آن نوبت به ماهوارک­ها[12] می­رسد که شامل ردیف­های تکراری بلندتر از 10 تا 15 جفت باز هستند که طول آن­ها 30 کیلوباز یا بیشتر است. کوچک­ترین عضو این خانواده شامل توالی­های ساده تکراری یا ریزماهواره[13] می­باشد که شامل توالی­های تکراری 6-1 جفت باز بوده و عموماً کوچک­تر از یک کیلو باز می­باشند (چیمبرز و مکاووی[14]، 2002).

ریزماهواره­ها یا توالی­های تکراری ساده (SSR)، عناصر تکراری متوالی و متشکل از واحدهای تکی، دوتایی، سه تایی یا چهارتایی هستند (سلطانلو و همکاران، 1388) که در ژنوم بیشتر یوکاریوت­ها پراکنده­اند. به طوری که در هر ده کیلو جفت باز از ردیف DNA دست کم یک ردیف ریزماهواره دیده می­شود (نقوی و همکاران، 1388). در گیاهان عالی در هر 100-30 کیلوباز بطور میانگین، یک SSR از نوع سه و چهار نوکلئوتیدی وجود دارد(سلطانلو و همکاران، 1388). ریز­ماهواره­ها در DNA هسته­ای تمام یوکاریوت­ها و پروکاریوت­ها از جمله باکتریها یافت شده (گابور[15] و همکاران، 2000) و بطور مکرر بوجود می­آیند (گوپتا[16] و همکاران، 1996).

ریز­ماهواره­ها در هر دو قسمت توالی­های کدکننده و غیر کدکننده در همه موجودات مورد مطالعه وجود دارند (کانتتی[17] و همکاران، 2002).  و ثابت شده که بطور یکنواخت در ژنوم پراکنده­اند، اگر چه در برخی نواحی می­توانند به صورت مجتمع قرار گرفته باشند (نقوی و همکاران، 1388).

کاربردهای ریزماهواره­ها در نقشه­یابی ژنومی، انگشت­نگاری DNA، نشانمند کردن ژن­ها، سازماندهی ژرم­پلاسم و مطالعات سیتوژنتیکی مشخص شده است (گوپتا و همکاران، 199). از کاربرد­های دیگر ریز­ماهواره­ها، می­توان به عنوان نشانگر مولکولی جهت (نقشه­یابی) ژن­ها در گندم و سایر گیاهان اشاره کرد (خلستکینا[18] و همکاران، 2002).

(پاورقی نشانگر مولکولی)

[1] Restriction fragment length polymorphis

[2] Polymorphism

[3] Restriction enzyme

[4] Botstein et al

[5]Random Amplified Polymorphism DNA

[6] Amplified Fragment Length Polymorphism

[7] Inter simple sequence repeat

[8] Nybom

[9] Amplified Fragment Length Polymorphism

[10] Simple Sequence Repeats

[11] Satellite

[12] Mini Satellite

[13] Micro Satellite

[14] Chambers and Macavoy

[15]Gabor et al

[16] Gupta et al

[17] Kantety et al

[18]Khelestkina et al

نشانگر مولکولی ISSR

روش ISSR-PCR  برای اولین بار توسط زیتکی­ویز و همکاران (1994) گزارش شد. ISSR­ها نشانگرهای نیمه اختیاری هستند که توسط PCR در حضور آغازگری که مکمل ریز­ماهواره هدف است، تکثیر می­شوند. تکثیر در حضور این آغازگرها به MP-PCR[1] نیز معروف است. چنین تکثیری نیاز به اطلاعات توالی نداشته و منجر به تولید الگوهای چند جایگاهی و بسیار چند شکل می­گردد. قطعات ISSR، توالی DNA به طور 3000-100 جفت باز می­باشند که بین دو ناحیه میکروستلایت[2] که در جهت مخالف هم قرار گرفته­اند، جای دارند. آغازگرهایی بر اساس ریزماهوارک طراحی و استفاده می­شوند تا توالی DNA بین دو ISSR را تکثیر کنند ( کومار[3] و همکاران، 2009).

طول آغازگرها می­تواند 16 تا 25 جفت باز باشد و ریزماهوارک استفاده شده می­تواند دو، سه، چهار یا پنج نوکلئوتیدی باشد. همچنین آغازگرها هم بصورت مهار نشده یا اکثراً مهار شده در انتهای 3 یا 5′ توسط 1 تا 4 باز می­باشند. این روش بخاطر استفاده از آغازگرهایی با طول بیشتر (16 تا 25) نسبت به RAPD با 10 نوکلئوتید از تکرار پذیری بالاتری برخوردار است. زیرا در صورت استفاده از آغازگرهای بلند می­توان دمای اتصال (45 تا 69) را افزایش داد که این امر سبب می­شود اختصاصی­تر عمل کند. مطالعات انجام شده بر روی تکرارپذیری نشان می­دهد که فقط ضعیف­ترین باندها تکرار­پذیر نیستند. حدود 92 تا 95 درصد از باندهای امتیاز داده شده می­توانند با استفاده از نمونه DNA از رقم مشابه و با استفاده از PCR جداگانه که با ژل اکریل­آمید شناسایی شده­اند، تکرار شوند (ردی[4] و همکاران، 2002) .

[1] Multiplex polymerase chain reaction

[2]Micro Satellite

[3] Kumar et al

[4]Reddy et al

نشانگر مولکولی

جهت مشاهده نمونه های دیگر از مبانی نظری پایان نامه مهندسی کشاورزی کلیک کنید..

 نمونه ای از منابع انگلیسی نشانگر مولکولی

• Abdi S, Fayyaz Moghadam A, Ghadim Zadeh M, Ghane Jahromi M. 2006. Evaluate effects of removing leaf with three intenses in four reproductive stages on oil yield of two sunflower cultivars. The 9th Iranian Crop Sciences Congress. Aboureyhan Campus, University of Tehran, Iran, 145 :27-29
• Ahkami A, Naghavi  M, Zadeh A.H,  Pirseiedi S,  Patki P,  Almoti  M.K,  Irandoost H.P, Bakhsh  M.O. 2007. Genetic Relationship in Durum Wheat (Triticum durum) Using AFLP Markers. Iranian Agricultural Science,  1: 25-35
• Anushri A, Mohapatra T, Sharma  R. 2004. Molecular Mapping and Marker Assisted Selection of Traits for Crop Improvement. National Research Center on Plant Biotechnology India Agricultural Research Institute, 289-330.
• Ajibade S.R, Weeden N.F, Chite S. 2000. Inter-simple sequence repeat analysis of genetic relationships in the genus Vigna. Euphytica, ll: 47-55
• Arcade A, Anselin F, Rampant P.F, Lesage M.C ,Paques L.E, Prat D. 2000. Application of AFLP, RAPD and ISSR markers to genetic mapping of European and Japanese larch. Theoretical and Applied Genetics, 100: 299-307
• Barrak k.m. 2006. Irrigation interval and nitrogen level effects on growth and yield of canola(Brassica napusl.). Scientific J. King Faisal Univ, 7: 87-99.
• Bhardwaj R.K.2009. Advances in oilseed research .Oxford Book Company,jaipur,india.288p
• Blair M.W, Panaud o, McCouch S.R. 1999. Inter simple sequence repeat (ISSR) amplification for analysis of micro satellite motif frequency and fingerprinting in rice (Oryza sativa L). Theoretical and Applied Genetics, 98:780-792
• Bornet B, Branchard M. 2001. Nonanchored inter simple sequence repeat (ISSR) markers: reproducible and specific tools for genome fingerprinting. Plant Molecular Biology Reports, 19: 209-215
• Botstein D, White  R.L, Skolnick M,  Davis  R.W. 1980. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms. Am. J. Hum. Genet, 32: 314-331.
• Chambers G.K, Macavoy E.S. 2000. Microsatellites: consensus and controversy. CBP, 126: 455-476
• Darvasi A, Soller M. 1994. Optimum spacing of genetic markers for determining linkage between marker loci and quantitative trait loci. Theoretical and Applied Genetics, 89: 351-357.
• Gabor T, Gaspar Z, jurka j. 2000. Microsatel1ite In different eukaryotic genomes: survey and analysis. Genome Research, 10: 967-981
• Godwini I.D, ALtken  E, Smith  L.W. 1997. Application of inter simple sequence repeat (lSSR) markers to plant genetics. Electrophoresis, 18: 1524-1528
• Gostirmsky S.A, Kokaeva Z.G, Konovalov F.A. 2005. Studying Plant Genome Variation Using Molecular Markers. Russian Journal of Genetics, 41: 480-492
• Gupta  P.K, Baylan H.S, Sharma  P.c, Ramesh B. 1996. Microsatellite In plants: a new class of molecular marker. Current Science, 70: 4-54
• Huang  j, Sun  S.M. 2000. Genetic diversity and relationships of sweet potato and its wild relatives in Ipomoea series Batatas (Convolvulaceae) as revealed by inter-simple sequence repeat
• …
• …