کشت بافت گیاهی کالوس

2-4- کشت بافت گیاهی…

2-4-1- طرز تهیه ریزنمونه گیاهی…

2-4-1-1- انتخاب ریزنمونه..

2-4-1-2- تأثیر مواد گیاهی و عوامل فیزیکی در رشد ریزنمونه..

2-4-2- روشهای مختلف کشت بافت گیاهی…

2-4-3- کشت کالوس….

2-4-3-1 کالوس….

2-4-4- هورمونهای گیاهی…

2-4-4-1- اکسین ها.

2-4-4-2- سیتوکنین ها.

2-4-4-3- جیبرلین ها.

2-4-4-5- اسید آبسیزیک….

2-4-4-6- اتیلن..

2-4-5- اسیدهای آمینه، آگار، pHو منبع انرژی..

2-4-6- تمایز سلولی(Cytodifferentation).

2-4-7- تمایز اندام.

2-4-7-1- اندام زایی…

2-4-7-2- اندام زایی از بافت کالوس….

2-4-8- کشت سوسپانسیون سلول های گیاهی…

2-4-9- تولید متابولیت های ثانویه در محیط درون شیشیه ای..

منابع

کشت بافت گیاهی کالوس

طرز تهیه ریزنمونه گیاهی

 انتخاب ریزنمونه

ریزنمونه می تواند اندام (ریشه، ساقه، برگ، گل، بذر و پیاز)، بافت (مریستم، پارانشیم) یا سلول (میکروسپور) باشد. ساده ترین نوع کشت، کشت اندام است مانند قلمه ساقه تک گرهی، گل کامل و سخت ترین نوع کشت، کشت سلول در محیط کشت مایع است. ریزنمونه باید از گیاه مادری تهیه شود که عاری از بیماری، دارای برنامه تغذیه مناسب و شبیه به گیاه مادری بوده و در گلخانه یا اتاقک رشدکه دارای شرایط محیطی مناسب است پرورش یافته باشد.

تأثیر مواد گیاهی و عوامل فیزیکی در رشد ریزنمونه

مواد گیاهی می تواند بر رشد و نمو ریزنمونه مؤثر باشد. گیاهان دو لپه ای نسبت به تک لپه ای به محیط درون شیشه اندامهای مختلفی تولید in vitro ای واکنش مثبت تری نشان می دهند. به طور کلی گیاهانی که در محیط می کنند، اگر در محیط درون شیشه ای کشت شوند نیز چنین اندامهایی را تولید می کنند.

سن گیاه نقش تعیین کننده ای را در واکنش ریزنمونه در محیط درون شیشه ای دارد. معمولاً بافتهای جنینی قدرت تکثیر بالاتری نسبت به بافتهای مسن دارند. بافتهای علفی و غیر خشبی نسبت به بافتهای خشبی واکنش مثبت تری نشان می دهند. به طور کلی اندامهای رویشی نسبت به اندامهای زایشی راحت تر تکثیر می شوند.

ریزنمونه ها پس از کشت در اتاقک رشد قرار داده می شوند. در اتاقک رشد 16 ساعت نور و 8 ساعت تاریکی تنظیم می گردد. البته بهترین دوره نوری برای ریزنمونه در محیط درون شیشه ای همان دوره نوری است که برای گیاه مادری مناسب است. در مورد بافت های بدون کلروفیل نیازی به وجود نور نیست، در صورتیکه ریزنمونه های کلروفیل دار جهت انجام فتوسنتز نیاز به نور دارند. برخی به غلط تصور می کنند که  ریزنمونه در محیط درون شیشه  در ظروف Co ₂ در داخل ظرف کشت کم است، در حالیکه میزان Co ای به شدت نور کم نیاز دارد و میزان ₂کشت به اندازه کافی وجود دارد. منبع تأمین نور در اتاقک کشت لامپهای فلورسنت هستند.

دما از دیگر عوامل مهم در اتاقک رشد می باشد. اکثر ریزنمونه های گیاهی در دمایی حدود 25 درجه سانتیگراد به خوبی رشد می کنند. البته گیاهان گرمسیری به دمای بالاتر (29-28 درجه سانتیگراد) و گیاهان پیازی به دمای کمتری (18 درجه سانتیگراد) نیاز دارند.

رطوبت نسبی اتاقک رشد نیز از عوامل مؤثر در رشد ریزنمونه است. معمولاً رطوبت نسبی اتاقک رشد بین 50-40 درصد تنظیم می شود. افزایش رطوبت موجب افزایش آلودگی های قارچی و کاهش آن موجب از دست رفتن آب ریزنمونه می شود.

تهویه مناسب و تأمین اکسیژن عامل مهم رشد سلولها و بافتها است. به همین جهت در صورتی که محیط کشت، مایع باشد باید آن را روی شیکر قرار داد و یا با استفاده از کاغذ صافی و ایجاد پل کاغذی، اکسیژن محیط کشت را تأمین نمود. در محیطهای کشت جامد با قرار دادن غیر قطبی ریزنمونه (به صورت وارونه) می توان اکسیژن مورد نیاز را تأمین نمود.

چون در محیط درون شیشه ای شدت نور کم و در نتیجه فتوسنتز پایین است، نیازی به افزودن Co₂وجود ندارد

ومعمولاً بیشتر نیازگیاه به هیدرات کربن از طریق افزودن ساکارز تأمین می شود.

روشهای مختلف کشت بافت گیاهی

کشت بافت گیاهی که انواع روشهای کشت گیاهان در شرایط استریل را تحت پوشش قرار می دهد، بایستی در موارد خاص استفاده شود و تقسیم آن به انواع مختلف کشت امکان پذیر است که عبارتند از:

• کشت بذر[1] کشت بذور درون شیشه به منظور تولید گیاهچه یا گیاه کامل.
• کشت جنین[2] کشت جنین جداشده از بالغ یا نابالغ.
• کشت اندام[3] کشت اندام های جداشده گیاهی، که به انواع مختلفی از جمله، کشت در سیستم نوک، کشت ریشه و کشت دانه گرده قابل تقسیم است.
• کشت کالوس[4] کشت یک بافت تمایز یافته از ریزنمونه و اجازه دادن به آن برای تمایز زدایی و تشکیل بافت کالوس.
• کشت سلول[5]کشت سلول های جداشده و یا توده های خیلی کوچک سلولی که در محیط مایع پراکنده می باشد.
• کشت پروتوپلاست[6] کشت پروتوپلاست های گیاهی، یعنی سلول های فاقد دیواره.

 کشت کالوس

 کالوس

کالوس یا پینه توده سلول پارانشیمی تمایز نیافته است. کالوس می تواند در واکنش به زخم، در محل بافتهای توموری، در محل جوش خوردن پیوند یا در محیط درون شیشه ای تولید شود. کالوس می تواند در تهیه پروتوپلاست، تولید جنین سماتیک، تولید اندامهای ریشه و ساقه و تولید متابولیت های ثانویه مورد استفاده قرار گیرد. برگ، اندام ذخیره ای (پیاز،غده)، گل و میوه از اندامهایی هستند که می توانند برای تولید کالوس مورد استفاده قرار گیرند. از جمله بافتها می توان به بافتهای پیش آوندی، مزوفیل برگ، لپه ها، دایره محیطیه ریشه و لایه آوندی اشاره کرد. معمولاً تشکیل کالوس در گیاهان دو لپه ای بیشتر از گیاهان تک لپه ای است. محیط کشت پایه که غنی از نیتروژن به خصوص نیترات و آمونیوم و فسفات است،LS تغییر یافته و محیط کشتMS  یا  MSتغییر یافته برای تولید کالوس مورد استفاده قرار می گیرد.

برای تولید کالوس قند های ساکارز یا گلوکز به مقدار 4-2 درصد (40-20 گرم در لیتر محیط کشت) به کار می رود. اسیدهای آمینه گلیسین و آرژنین تأثیر مثبتی بر تولید کالوس دارند، همچنین کازئین هیدرولیز شده به محیط کشت اضافه می شود. تنظیم کننده های رشد از جمله اکسین ها و سیتوکنین ها نقش به سزایی در تولید کالوس دارند. غلظت متوسط تا بالای اکسین ها از جمله اسید نفتالین استیک، اسید ایندول استیک و 2,4-D برای تولید کالوس ضروری است. از جمله سیتوکنین ها می توان به کینتین و بنزیل آدنین اشاره کرد که با غلظت کمتری نسبت به اکسینها، مورد استفاده قرار می گیرد.

محیط کشت جامد برای کشت کالوس دارای معایبی به شرح ذیل است:

• در محیط کشت جامد، توده کالوس در سطح محدودی با محیط کشت در تماس است، در نتیجه مواد کمتری از محیط کشت جذب می کند و تعادلی در رشد در اثر مواد غذایی جذب شده، گازهای تبادل شده و فرآورده های پس مانده سمی بین کالوسو محیط کشت وجود ندارد.
• در محیط کشت جامد تأمین اکسیژن کمتر از محیط کشت مایع است.
• توده های کالوس در محیط کشت مایع به قطعاتی تقسیم می شوند و در سطح بیشتری تولید می شوند، در نتیجه جذب مواد غذایی از محیط کشت افزایش می یابد که در محیط کشت جامد چنین نیست.
• در محیط کشت جامد، افزودنیهایی وجود دارد که باعث تسریع در تمایز می شوند و از رشد کالوس جلوگیری می کنند.

واکشت کالوس یعنی انتقال کالوس از یک محیط کشت به محیط کشت دیگر که به دلایل زیر صورت می گیرد:

• تجمع مواد زائد در محیط کشت.
• تخلیه مواد غذایی محیط کشت.
• خشک شدن محیط کشت.

معمولاً اگر دمای اتاق رشد حدود 25 درجه سانتیگراد باشد هر 6-4 هفته یکبار لازم است کالوس به محیط جدید منتقل شود. کالوس ها پس از واکشتهای مکرر قادر به تأمین اکسین و سیتوکنین بوده و از این نظر خودکفا می شوند که به آن عادت کردن می گویند.

کالوسها از نظر رنگ و برخی صفات دیگر می توانند متفاوت باشند.کالوس ها از نظر رنگ به دو دسته تقسیم می شود: کالوس های تیره که دارای سایه های کرم، زرد، بژ یا قهوه ای می باشند و کالوسهای روشن که گاهی اوقات (نه همیشه) سبز هستند و ممکن است دارای رنگدانه های قرمز (آنتوسیانین) یا تیره (ترکیبات فنولی) باشند.

از نظر بافت نیز کالوس ها متفاوت بوده و برخی نرم و براحتی قابل جدا کردن هستند (کالوس هویج) و برخی سفت و محکم هستند (کالوس آنتوریوم). از نظرسرعت رشد نیز، کالوس ها متفاوتند و معمولاً بعد از گذشت یک تا چند هفته مقدار کالوس قابل مشاهده است. معمولاً مدت زمان دوبرابر شدن یک توده کالوس مستقر شده یک هفته یا بیشتر می باشد.

شاخص های متعددی برای ارزیابی کالوس ها وجود دارندکه از جمله آنها می توان به وزن تر، درصد وزن خشک، شمارش تعداد سلول، شاخص میتوزی کالوس و شاخص تنفس کالوس اشاره کرد.

جهت مشاهده نمونه های دیگر از مبانی نظری پایان نامه کشاورزی کلیک کنید.

نمونه ای از منابع لاتین

• Abdih, MZ. Israr, M.Rehman , R.U. and  S. K. Jain(2003) Artemisinin  a  novel  antimalarial  drug : biochemical  and  molecular  approaches   for  enhanced  production  . plant  a  Med .69:289-299.
• Ali  M. B. Hahn E. G., Peak K. E. Effect of temperature on oxidative stress defense system , Lipid proxidation and Lipoxygenase activity in Phalaenopsis.Plant Physiology and Biochemistry.2005; 43:213-223.
• Alscher R. G. Donahue J. L. and Cramer L L. Reactive oxygen species and anti oxidants: relationship in green cells.Physiols. plant.1997; 100: 223-224
• Archana, G. Sarish, T. Dhingra, V. and  M. L. Narasu (2002). Inflvence of different strains of  Agrobacterivm  rhizogenes  on  indoction  of  hairy  roots and  arhemisinin  prodoction  in  Artemisia  anna. Cvrrent  Scienece vol :81
• Beyer, E. M. J. (1976) A plant inhibitor of ethylene action in plant. Plant Physiol. 58:268-271.
• Bohlmannm, J. Meyer, G. and R. Croteau. (1998) Plant terpenoid synthases: molecular and phytogenic analysos. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 95:4126-4133.
• Bonfil M., Bentebibel S. Moyano E., Palazon J., Cusido R. M,Eibl R. and Pinol M. T.Paclitaxel and baccatin 111 production induced by methyl jasmonate in free and immobilized cell of taxus baccata.biologya plantarum.2007; 4: 647-652
• Bowler C. , Montague M. V. Inze D. Superoxide Dismutase and stress tolerance. A.annu. Rev. Plant physiol. Plant mol.Biol.1992; 43: 83-116
• Chen W. H, Xu. C. M. Zeng J. l. Zhao B., Wing X. D. Wang Y. C.  Improvement of echinacoside and acteoside production by two atage elicitationin cell suspension culture of Cistanche deserticola .World J Microbiol .2007 ; 23:1451-1458
• Chen, D. H. Ye, H. C. and G. F. Li. (2000) Expresion of chemeric farnesyl diphophate synthase gen in Artemisia annua transgenic plant via Agrobacterium tumefaciens- mediated transformation, plant Sci. 155:179-185.
• Cho H. Y,. Lee- Parsons c. w  t , yoon s y h , rhee h s , park j m . enhanced benzophenanthridine alkaloid production and   expression with combind elecitor in eschscholczia. Californica suspension culture.biotecnol lett.2007;29:2001-2005.
• christensen g. h., bauw g., welinder k. g. montagu m.v. and boerjon w. purfivation and characterization of proxidases cocorrelated with lignifications in poplar zylem.plant physiology 1998;118: 125-135.
• …
• …