پروتئین های نوترکیب (پروتئین TNF-α)

پروتئین های نوترکیب

پروتئین های نوترکیب

منابع پروتئین های نوترکیب

سیستم­های بیان کننده مورد استفاده در تولید پروتئین های نوترکیب

انتخاب نوع سیستم بیان کننده برای تولید انبوه پروتئین های نوترکیب، به عوامل متعددی وابسته است که در این بین می­توان ویژگی­های رشد سلول میزبان، میزان بیان پروتئین های نوترکیب، بیان درون سلولی یا خارج سلولی، تغییرات پس از ترجمه پروتئین فعالیت زیستی و خصوصیات پروتئین مورد نظر و هدف نهایی استفاده از پروتئین بیان شده را نام برد(Makrides, 1996).

امروزه از سيستم­هاي بيان كننده متعددي براي توليد پروتئین های نوترکیب استفاده مي­كنند كه به دو گروه تقسيم مي­شوند.

• سيستم­هاي پروكاريوتيك شامل اشرشياكلي، باسيلوسوبتيليس، سودوموناس، اروينيا و…
• سيستــم­هاي يوكاريوتيــك مخمرهـــا، حشرات، سلول­هاي پستانـداران و سلول­هـاي گياهي
  Johnson and et al., 1988)).

هر یک از سیستم­های بیان کننده که در بالا ذکر شد دارای مزایا و معایبی هستند که در جدول 2-1 ارائه شده است.

جدول2-1: معایب و مزایای سیستم­های بیان کننده مختلف جهت تولید پروتئین های نوترکیب (Walsh and Headon, 1994)

  باکتری E. coli بعنوان میزبان بيان کنندة پروتئین های نوترکیب

در فرآیند تولید یک پروتئین های نوترکیب گام اول بیان پروتئین هدف در میزبانE. coli  است. اشرشیاکلی یک باکتری گرم منفی است و فقط یک کروموزوم دارد که در ساختار به هم فشرده­ای به نام نوکلوئید^[1] بسته­بندی شده است. E. coli به دليل دارا بودن ويژگي­هايي از قبيل تكثير سريع، مصرف كم مواد اوليه، كنترل آسان رشد، بيان بالاي پروتئین نو­ترکیب، قدرت بالاي پذيرش ژن­هاي بيگانه، شناخت ويژگي­هاي ژنتيكي و فيزيولوژي آن را به عنوان ميزباني بسيار كارآمد براي تحقيقات مهندسي ژنتيك و دستكاري­هاي ژنتيكي ساخته است. سويه­اي از باكتري E. coli بنام Kl2 به طور گسترده­ای تحت مطالعات بیولوژیکی قرار گرفته و تمام سویه­های جدید از این سویه اصلی مشتق شده­اند(محمود­پور، م، 1381). بطور معمول براي بيان ژن و توليد انبوه پروتئين از سويه­هايي مانند DE3 (BL21) استفاده مي­شود.

مسائلي در مورد توليد پروتئین های نوترکیب در اشرشياکلي

پايداري پلاسميد

عوامل متعددي از قبيل ميزان رونويسي ژن کلون شده، شرايط رشد، مارکرهاي شناساگر، استعداد ژنتيکي ميزبان و سميت ژن­هاي موجود بر روي وکتور به ميزان زيادي پايداري پلاسميد را تحت تاثير قرار مي دهد. ناپايداري­هاي پلاسميدي را مي­توان به سه گروه عمده تقسيم نمود.

1- ناپايداري تسهيمي^[1] که از سيستم ناقص توزيع DNA پلاسميدي در طي تقسيم سلول ناشي مي­شود. همچنين ترکيب محيط کشت، تثبيت سلولي، دما، هوادهي و PH از جمله عوامل موثر بر ناپايداري تسهيمي هستند(Beal and et al., 1998)‌ .متاسفانه يک فرمول خاصي براي افزايش ميزان پايداري پلاسميد به وسيله تنظيم شرايط محيط کشت وجود ندارد و اين شرايط براي حالت­هاي مختلف بيان ژن و حتي ممکن است براي بيان ژن­هاي مختلف متفاوت باشد. به طور کلی سلول­هاي حاوي پلاسميد به انرژي بيشتري نسبت به سلول­هاي بدون پلاسميد نياز دارند. بنابراين بايد از کمبود اکسيژن و مواد­غذايي در طي رشد و فرمانتاسيون^[2] جلوگيري شود(Edlin and et al., 1984).

2- ناپايداري ساختاري که از تغييرات در ساختار DNA پلاسميدي، نظير حذف، دخول يا بازآيي ناشي مي­شود. پايداري ساختاري پلاسميد به ويژگي­هاي ژنتيکي ميزبان، ساختمان پلاسميد و شرايط رشد بستگي دارد.3- ناپايداري رقابتي^[3] که از برتري رشد سلول­هاي فاقد پلاسميد نسبت به سلول­هاي واجد پلاسميد در محيط­هاي کشت ناشي مي­شود(Strandberg and et al.,1991 and Huang and et al., 1997).

فاکتور نکروز کننده تومور (TNF):

فاکتور نکروز کننده تومور یکی از سایتوکاین­هاي دخيل در راه­اندازی و تنظیم سيستم ايمني ذاتی است که پاسخ­های التهابی حاد در برابر باکتری­های گرم منفی و سایر میکروب­ها را وساطت می­کند
(Abul and Lichtman, 2007). براي اولين بار TNF به عنوان فاكتوري كه در مرگ سلول­هاي توموري نقش ايفاء مي­كرد از سرم موش­هاي تيمار شده با آندوتوكسين باكتري­ها جدا­سازي شدSanjay, 2007) ) اگر چه وجه تسمیه این فاکتور به علت ویژگی­های ضد توموری آن است اما TNF در طیف گسترده­ای از بیماری­ها دخالت دارد.

فاکتور نکروز کننده تومور راTNFα  نيز مي­نامند تا از TNFβ يا لنفوتوکسین(LT)  متمایز شود(Abul and Lichtman, 2007). مقایسه توالی آمینو­اسیدی TNF و LT نشان دهنده ارتباط نزدیک آنها است از طرفی بررسی نقشه کروموزومی نشان می­دهد که ژن­های کد کننده آنها بر روی بازوی کوتاه کروموزوم 6 و در مجاورت ژن­هاي MHC (Major Histocompatibility Complex) در کنار هم دیگر قرار می­گیرند و این حاکی از آن است که این دو از یک ژن مشترک منشاء گرفته­اند (Old, 1985).

تنوع تيپ­هاي سلولي كه  فاکتور نکروز کننده تومور در آنها بيان مي­شود در مقایسه با لنفوتوکسین بیشتر است. TNFα غالباً توسط ماکروفاژهای فعال، لنفوسیت هایT ­ي CD4⁺، لنفوسیت­هایT ­ي­­­­CD8⁺، سلول­های NK، بيان مي­شوند. بیان آن در سلول­های دیگر مانند فیبروبلاست­ها، سلول­های عضلات صاف و سلول­های توموری پایین است(Vilcek and Lee, 1991). بعلاوه اين ژن در سال 1985 توسط Duinppon كلون شد.

نقش بيولوژيكي TNFα:

فاکتور نکروز كننده تومور آلفا ((TNFα سایتوکایني با عملكرد­هاي متعددي است و مسير­هاي سيگنالي زيادي را در سلول القاء مي­كند. علاوه بر دخالت در آپوپتوزیس، زنده ماندن سلول، التهاب، تنظيم خواب و رشد رويان دارای نقش­هاي درماني مهمی مانند مقاومت به عوامل عفوني و نيز مقاومت به تومور مي باشد (Vilcek and Lee, 1991.,Wride and Sanders, 1995., Aggarwal, 2003 and Krueger, 2008).

TNFα قادر به القاء مرگ سلولي آپوپتوزي و نكروزي مي­باشد(Beyaert and Fiers, 1994). نكروزه شدن با ويژگي­هايي مانند متورم شدن سلول، تخريب اندامك­ها، ليز شدن سلول و پاسخ­هاي التهابي همراه است در حالي كه آپوپتوز يك فرآيند بيوشيميايي است كه با ويژگي­هاي مورفولوژيكي خاصي مانند چروكيده شدن سلول، تشكيل اجسام آپوپتوزي و تشكيل قطعات DNA نوكلئوزومي مشخص مي گردد(Steller, 1995).

TNFα ممكن است از طريق فعال كردن نوتروفيل­ها، پلاكت­ها و افزايش توانايي ماكروفاژها، سلول­هاي NK و تحريك سيستم ايمني باعث ايجاد مقاومت در برابر عفونت­ها مي­شود. از طرفي در برخي بيماري­هاي خود ايمني مانند آرتريت روماتوئيد نيز نقش ايفاء مي­كند(Abul and Lichtman, 2007).

پروتئین های نوترکیب

جهت مشاهده نمونه های دیگر از فصل دوم مهندسی کشاورزی کلیک کنید.

نمونه ای از منابع لاتین پروتئین های نوترکیب

• Abul, A. K. and Lichtman, A. H. (2007). Cellular and Molecular Immunology. W.B Saunders Company.
• Aggarwal, B. B. (2003). Signalling pathways of the TNF superfamily: a double-edged sword. Nature Reviews Immunology., 3: 745-756.
• Ashkenazi, A. and Dixit, V. M. (1999). Apoptosis control by death and decoy receptors. Current Opinion in Cell Biology., 11(2): 255-260.
• Balbas, P. and Bolivar, F. (1990). Design and construction of expression plasmid vectors in Escherichia coli. Methods in Enzymology., 185: 14-37.
• Banerjee, S. and Apte Deshpande, N. (2009). A Novel Cytokine Derived Fusion Tag for Over-Expression of Heterologous Protein in E. coli. International Journal of Biological and Life Sciences.1(3): 129-133.
• Baneyx, F. (1999). Recombination protein expression in Eschershia coli. Current Opin Biothecnology., 10: 411-421.
• Beal, C., D’Angio, C., et al. (1998). pH influences growth and plasmid stability of recombinant Lactococcus lactis subsp. lactis. Biotechnology Letters., 20(7): 679-682.
• Berent, S. L., Torczynski, R. M., et al. (1986). Sendai virus induces high levels of tumor necrosis factor mRNA in human peripheral blood leukocytes. Nucleic Acids Research.14(22): 8997-9015.
• Beutler, B. and Bazzoni, F. (1998). apoptosis ana autoimmunity: a common thread? Blood Cells Mol Dis., 24: 216-230.
• …
• …