قیمت 19,000 تومان

اشتراک 0دیدگاه 62 بازدید

پروتئین های نوترکیب

پروتئین های نوترکیب

فصل اول: بررسی منابع پروتئین های نوترکیب
1-1- بیوتکنولوژی پروتئین­های دارویی 1
2-1- کلون­کردن ژن 3
                         1-2-1- ابزار و عوامل کلون­کردن ژن 4
                                    1-1-2-1- آنزیم­های برشی 4
                                   2-1-2-1- آنزيم DNA لیگاز 5
                         2-2-1- وکتورهای کلونینگ 6
                                     1-2-2-1- پلاسمیدها 10
3-1- سیستم­های بیان کننده مورد استفاده در تولید پروتئین های نوترکیب 11
                       1-3-1- باکتری E. coli بعنوان میزبان بيان کنندة پروتئین های نوترکیب 15
                       2-3-1- وكتور بيان­كننده 15
                                    1-2-3-1- پروموتر 16
                                               1-1-2-3-1- پروموتر T7 و سیستم بیانی PET 17
                                    2-2-3-1- منشاء همانند­سازی 18
                                   3-2-3-1- ماركر انتخابي 18
                                    4-2-3-1- خاتمه دهنده رونويسي 19
                                    5-2-3-1- سيگنالهاي ترجمه يكي از عوامل مؤثر در افزايش بيان 19
                                   6-2-3-1- انتخاب كدون 20
4-1- مسائلي در مورد توليد پروتئین های نوترکیب در اشرشياکلي 21
                        1-4-1- پايداري پلاسميد 21
                       2-4-1- عدم حذف متيونين در انتهاي N ترمينال پروتئین های نوترکیب 22
                        3-4-1- بار متابوليکي 23
                        4-4-1- مشکلات بيان پروتئین های نوترکیب در سيتوپلاسم باکتري اشرشياکلی. 23
5-1- سيستم ایمنی ذاتی و اكتسابي 25
6-1- سایتوکاین­ها 25
                        1-6-1- فاکتور نکروز کننده تومور (TNF) 26
                                     1-1-6-1- ويژگي­هاي ژن و مولكول TNFα 27
                                     2-1-6-1- ويژگي هاي ساختاري پروتئين TNF 28
                                     3-1-6-1- ساختار گیرنده TNF و سوپرفاميلي آنها 29
                                     4-1-6-1- نقش بيولوژيكي TNFα 31
                                     5-1-6-1- مكانيسم عمل 31
7-1- TNF-α و نقش آن در برخي از بيماري­های تحلیل عصبي 34
                       1-7-1- TNF و بیماری آلزایمر(AD) 34
                       2-7-1- TNF و ایسکمی مغزي 35
                       3-7-1- TNF و بیماری پارکینسون 36

منابع پروتئین های نوترکیب

پروتئین های نوترکیب (پروتئین TNF-α)

سیستم­های بیان کننده مورد استفاده در تولید پروتئین های نوترکیب

انتخاب نوع سیستم بیان کننده برای تولید انبوه پروتئین های نوترکیب، به عوامل متعددی وابسته است که در این بین می­توان ویژگی­های رشد سلول میزبان، میزان بیان پروتئین های نوترکیب، بیان درون سلولی یا خارج سلولی، تغییرات پس از ترجمه پروتئین فعالیت زیستی و خصوصیات پروتئین مورد نظر و هدف نهایی استفاده از پروتئین بیان شده را نام برد(Makrides, 1996).

امروزه از سيستم­هاي بيان كننده متعددي براي توليد پروتئین های نوترکیب استفاده مي­كنند كه به دو گروه تقسيم مي­شوند.

  • سيستم­هاي پروكاريوتيك شامل اشرشياكلي، باسيلوسوبتيليس، سودوموناس، اروينيا و
  • سيستــم­هاي يوكاريوتيــك مخمرهـــا، حشرات، سلول­هاي پستانـداران و سلول­هـاي گياهي
    Johnson and et al., 1988)).

هر یک از سیستم­های بیان کننده که در بالا ذکر شد دارای مزایا و معایبی هستند که در جدول 2-1 ارائه شده است.

جدول2-1: معایب و مزایای سیستم­های بیان کننده مختلف جهت تولید پروتئین های نوترکیب (Walsh and Headon, 1994)

معایب مزایا میزبان
پروتئین نو­ترکیب فاقد تغییرات پس از ترجمه خواهد بود. تنوع زیاد اشرشیاکلی
فعالیت زیستی و ایمنی­زایی پروتئین نو­ترکیب ممکن است متفاوت از پروتئین طبیعی باشد. امکان کنترل بیان ژن
پروتئین­های بیان شده گاهی به صورت اجسام ذخیره(inclusion bodies) در می­آیند. تولید پروتئین نو­ترکیب بسیار بالا است (تقریباً 50 در صد کل پروتئین­های سلولی)
رشد سریع و کشت آسان
پروتئین نو­ترکیب قابل بیان به صورت پروتئین­های الحاقی است.
  پروتئین نو­ترکیب را می­توان طوری طراحی کرد که به محیط کشت ترشح شود.
امکان تولید انبوه پروتئین نوترکیب، همانند E. coli وجود ندارد. پروتئین بیان شده به صورت الحاقی را مستقیماً به محیط کشت ترشح می کند. استافیلوکوکوس اورئوس
یک عامل بیماری­زا است.
ژنتیک آن به خوبی شناخته نشده است. فاقد آندوتوکسین است. مخمر سارکارومیس سرویزیه
کنترل بیان ژن در آن به سادگی امکان­پذیر نیست. به عنوان میکروارگانیسم بی­ضرر شناخته شده است. (GRAS15)

 

معایب مزایا میزبان
دستکاری ژنتیکی پلاسمید­های مخمری مشکل است. برای انسان بیماری­زا نیست.
وکتورهای کلونینگ کمی در دسترس است. تولید انبوه پروتئین و فرآیند­های پایین دستی آن به خوبی راه­اندازی شده است.
گلیکوزیلاسیون مخمر مشابه گلیکوزیلاسیون پستاندارن نیست. فرمانتاسیون مخمر بسیار ارزان است.
امکان گلیکوزیلاسیون و تشکیل باند­های دی­سولفیدی در آن فراهم است.  
فقط 5/0 در صد پروتئین­های طبیعی ترشح می­شوند که این امر تخلیص پروتئین نو­ترکیب ترشح شده به محیط کشت را آسان می­سازد.  
بیان پروتئین نو­ترکیب به صورت انبوه امکان پذیر نیست. تجارب فراوانی از فرمانتاسیون قارچ­های رشته­ای در دسترس است. قارچ آسپرزیلوسSP
ژنتیک آن به خوبی شناخته نشده است. رشد آن ارزان است.  
وکتورهای کلونینگ در دسترس نیست. منبع بسیاری از آنزیم­های صنعتی است.  
آسپرژیلوس نیجر، GRAS است.  
  مقادیر فراوانی از پروتئین را می­تواند به محیط کشت ترشح کند.  
عدم مشابهت سیستم­های گلیکوزیلاسیون حشرات و پستانداران واجد بسیاری از مکانیسم­های پردازشی لازم برای پروتئین­های یوکاریوت­های عالی­تر است. کشت سلول­های حشرات

(Baculovirus

vector)

پروتئین نوترکیب تولید شده همیشه 100 در صد فعال نیست. وکتور باکولوویروسی برای آزمایش­های کلینیکی پروتئین­های نو­ترکیب توسط FDA تایید شده است.  

 

معایب مزایا میزبان
  تفاوت بسیار کم در عملکرد و خصوصیات آنتی­ژنیک محصولات نو­ترکیب وجود دارد.  
  به دلیل عفونت­های ویروسی در سلول­های کشت شده، تولید پروتئین­های میزبان تا حدی متوقف می­شود ولی ژنهای خارجی در سطوح بسیار بالا بیان می­گردد.  
  تخلیص مقرون به صرفه و ساده پروتئین نوترکیب امکان­پذیر است.  
کشت سلول­ها مشکل است. فعالیت زیستی پروتئین در آن مشابه پروتئین­های طبیعی است. سلول­های پستانداران
در صنعت گران است. وکتورهای بیان کننده پروتئین­های پستانداران به صورت تجاری در دسترس است.  
رشد سلول­ها به کندی انجام می­گیرد. آنها را می­توان در مقیاس انبوه کشت داد.  
سلول­های دستکاری شده ژنتیکی معمولاً ناپایدارند.  

 

  باکتری E. coli بعنوان میزبان بيان کنندة پروتئین های نوترکیب

در فرآیند تولید یک پروتئین های نوترکیب گام اول بیان پروتئین هدف در میزبانE. coli  است. اشرشیاکلی یک باکتری گرم منفی است و فقط یک کروموزوم دارد که در ساختار به هم فشرده­ای به نام نوکلوئید[1] بسته­بندی شده است. E. coli به دليل دارا بودن ويژگي­هايي از قبيل تكثير سريع، مصرف كم مواد اوليه، كنترل آسان رشد، بيان بالاي پروتئین نو­ترکیب، قدرت بالاي پذيرش ژن­هاي بيگانه، شناخت ويژگي­هاي ژنتيكي و فيزيولوژي آن را به عنوان ميزباني بسيار كارآمد براي تحقيقات مهندسي ژنتيك و دستكاري­هاي ژنتيكي ساخته است. سويه­اي از باكتري E. coli بنام Kl2 به طور گسترده­ای تحت مطالعات بیولوژیکی قرار گرفته و تمام سویه­های جدید از این سویه اصلی مشتق شده­اند(محمود­پور، م، 1381). بطور معمول براي بيان ژن و توليد انبوه پروتئين از سويه­هايي مانند DE3 (BL21) استفاده مي­شود.

 

مسائلي در مورد توليد پروتئین های نوترکیب در اشرشياکلي

پايداري پلاسميد

عوامل متعددي از قبيل ميزان رونويسي ژن کلون شده، شرايط رشد، مارکرهاي شناساگر، استعداد ژنتيکي ميزبان و سميت ژن­هاي موجود بر روي وکتور به ميزان زيادي پايداري پلاسميد را تحت تاثير قرار مي دهد. ناپايداري­هاي پلاسميدي را مي­توان به سه گروه عمده تقسيم نمود.

1- ناپايداري تسهيمي[1] که از سيستم ناقص توزيع DNA پلاسميدي در طي تقسيم سلول ناشي مي­شود. همچنين ترکيب محيط کشت، تثبيت سلولي، دما، هوادهي و PH از جمله عوامل موثر بر ناپايداري تسهيمي هستند(Beal and et al., 1998)‌ .متاسفانه يک فرمول خاصي براي افزايش ميزان پايداري پلاسميد به وسيله تنظيم شرايط محيط کشت وجود ندارد و اين شرايط براي حالت­هاي مختلف بيان ژن و حتي ممکن است براي بيان ژن­هاي مختلف متفاوت باشد. به طور کلی سلول­هاي حاوي پلاسميد به انرژي بيشتري نسبت به سلول­هاي بدون پلاسميد نياز دارند. بنابراين بايد از کمبود اکسيژن و مواد­غذايي در طي رشد و فرمانتاسيون[2] جلوگيري شود(Edlin and et al., 1984).

2- ناپايداري ساختاري که از تغييرات در ساختار DNA پلاسميدي، نظير حذف، دخول يا بازآيي ناشي مي­شود. پايداري ساختاري پلاسميد به ويژگي­هاي ژنتيکي ميزبان، ساختمان پلاسميد و شرايط رشد بستگي دارد.3- ناپايداري رقابتي[3] که از برتري رشد سلول­هاي فاقد پلاسميد نسبت به سلول­هاي واجد پلاسميد در محيط­هاي کشت ناشي مي­شود(Strandberg and et al.,1991 and Huang and et al., 1997).

 

فاکتور نکروز کننده تومور (TNF):

فاکتور نکروز کننده تومور یکی از سایتوکاین­هاي دخيل در راه­اندازی و تنظیم سيستم ايمني ذاتی است که پاسخ­های التهابی حاد در برابر باکتری­های گرم منفی و سایر میکروب­ها را وساطت می­کند
(Abul and Lichtman, 2007). براي اولين بار TNF به عنوان فاكتوري كه در مرگ سلول­هاي توموري نقش ايفاء مي­كرد از سرم موش­هاي تيمار شده با آندوتوكسين باكتري­ها جدا­سازي شدSanjay, 2007) ) اگر چه وجه تسمیه این فاکتور به علت ویژگی­های ضد توموری آن است اما TNF در طیف گسترده­ای از بیماری­ها دخالت دارد.

فاکتور نکروز کننده تومور راTNFα  نيز مي­نامند تا از TNFβ يا لنفوتوکسین(LT)  متمایز شود(Abul and Lichtman, 2007). مقایسه توالی آمینو­اسیدی TNF و LT نشان دهنده ارتباط نزدیک آنها است از طرفی بررسی نقشه کروموزومی نشان می­دهد که ژن­های کد کننده آنها بر روی بازوی کوتاه کروموزوم 6 و در مجاورت ژن­هاي MHC (Major Histocompatibility Complex) در کنار هم دیگر قرار می­گیرند و این حاکی از آن است که این دو از یک ژن مشترک منشاء گرفته­اند (Old, 1985).

تنوع تيپ­هاي سلولي كه  فاکتور نکروز کننده تومور در آنها بيان مي­شود در مقایسه با لنفوتوکسین بیشتر است. TNFα غالباً توسط ماکروفاژهای فعال، لنفوسیت هایT ­ي CD4+، لنفوسیت­هایT ­ي­­­­CD8+، سلول­های NK، بيان مي­شوند. بیان آن در سلول­های دیگر مانند فیبروبلاست­ها، سلول­های عضلات صاف و سلول­های توموری پایین است(Vilcek and Lee, 1991). بعلاوه اين ژن در سال 1985 توسط Duinppon كلون شد.

ساختار كريستالي TNFα

نقش بيولوژيكي TNFα:

فاکتور نکروز كننده تومور آلفا ((TNFα سایتوکایني با عملكرد­هاي متعددي است و مسير­هاي سيگنالي زيادي را در سلول القاء مي­كند. علاوه بر دخالت در آپوپتوزیس، زنده ماندن سلول، التهاب، تنظيم خواب و رشد رويان دارای نقش­هاي درماني مهمی مانند مقاومت به عوامل عفوني و نيز مقاومت به تومور مي باشد (Vilcek and Lee, 1991.,Wride and Sanders, 1995., Aggarwal, 2003 and Krueger, 2008).

TNFα قادر به القاء مرگ سلولي آپوپتوزي و نكروزي مي­باشد(Beyaert and Fiers, 1994). نكروزه شدن با ويژگي­هايي مانند متورم شدن سلول، تخريب اندامك­ها، ليز شدن سلول و پاسخ­هاي التهابي همراه است در حالي كه آپوپتوز يك فرآيند بيوشيميايي است كه با ويژگي­هاي مورفولوژيكي خاصي مانند چروكيده شدن سلول، تشكيل اجسام آپوپتوزي و تشكيل قطعات DNA نوكلئوزومي مشخص مي گردد(Steller, 1995).

TNFα ممكن است از طريق فعال كردن نوتروفيل­ها، پلاكت­ها و افزايش توانايي ماكروفاژها، سلول­هاي NK و تحريك سيستم ايمني باعث ايجاد مقاومت در برابر عفونت­ها مي­شود. از طرفي در برخي بيماري­هاي خود ايمني مانند آرتريت روماتوئيد نيز نقش ايفاء مي­كند(Abul and Lichtman, 2007).

پروتئین های نوترکیب

جهت مشاهده نمونه های دیگر از فصل دوم مهندسی کشاورزی کلیک کنید.

نمونه ای از منابع لاتین پروتئین های نوترکیب

  • Abul, A. K. and Lichtman, A. H. (2007). Cellular and Molecular Immunology. W.B Saunders Company.
  • Aggarwal, B. B. (2003). Signalling pathways of the TNF superfamily: a double-edged sword. Nature Reviews Immunology., 3: 745-756.
  • Ashkenazi, A. and Dixit, V. M. (1999). Apoptosis control by death and decoy receptors. Current Opinion in Cell Biology., 11(2): 255-260.
  • Balbas, P. and Bolivar, F. (1990). Design and construction of expression plasmid vectors in Escherichia coli. Methods in Enzymology., 185: 14-37.
  • Banerjee, S. and Apte Deshpande, N. (2009). A Novel Cytokine Derived Fusion Tag for Over-Expression of Heterologous Protein in E. coli. International Journal of Biological and Life Sciences.1(3): 129-133.
  • Baneyx, F. (1999). Recombination protein expression in Eschershia coli. Current Opin Biothecnology., 10: 411-421.
  • Beal, C., D’Angio, C., et al. (1998). pH influences growth and plasmid stability of recombinant Lactococcus lactis subsp. lactis. Biotechnology Letters., 20(7): 679-682.
  • Berent, S. L., Torczynski, R. M., et al. (1986). Sendai virus induces high levels of tumor necrosis factor mRNA in human peripheral blood leukocytes. Nucleic Acids Research.14(22): 8997-9015.
  • Beutler, B. and Bazzoni, F. (1998). apoptosis ana autoimmunity: a common thread? Blood Cells Mol Dis., 24: 216-230.

نقد و بررسی‌ها

هنوز بررسی‌ای ثبت نشده است.

اولین کسی باشید که دیدگاهی می نویسد “پروتئین های نوترکیب (پروتئین TNF-α)”

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *

لطفا برای ارسال یا مشاهده تیکت به حساب خود وارد شوید